水样病毒核酸提取

从环境水样中提取微生物DNA，首先需要从水中分离微生物细胞。最早采用也是最完美的方法是用特定孔径大小的滤膜过滤大体积水样。出于这种考虑，MOBIO的PowerWater DNA和RNA提取试剂盒就是设计用来提取水样滤膜上的核酸的。这些试剂盒带有5mL研磨管，标准尺寸的47mm水样滤膜稍微卷起即可轻松放入。所有0.2或0.4μm孔径的滤膜都没问题，屡试不爽。所有细菌、真菌和原生动物都会留在滤膜上，病毒除外。所以提取环境水样中的病毒就成了一件棘手的事情。

最近我们收到关于如何提取水样中病毒来信。这是MOBIO技术部经常遇到的问题。

亲爱的技术部同志：
我们希望用MOBIO的Powerwater DNA提取试剂盒提取水样中的病毒DNA。可是我们担心病毒没办法用0.2μm孔径的水样滤膜捕捉。我们还能用这款试剂盒吗？
祝好！

答案是肯定的。首先，需要把病毒浓缩到非常小的体积。建议浓缩到200μl甚至更小，免得稀释了试剂盒中的化学试剂。但是病毒尺寸一般非常小，大概0.03μm-0.3μm。要滤下这么小尺寸的东西需要用超过滤法。能捕捉小于0.1μl物体的滤膜非常容易堵塞。超过滤法还需要适当加压，挤压液体通过滤膜的微小细孔。达到这些条件花费不菲，更别说在野外操作或者大体积水样了。

离心是另一个从水样中分离微生物的方法，也能用于病毒。细菌较重，只要很低的离心力（＜3000g）不到一分钟就能离下来。而要把病毒沉淀下来则可能要大于100000g离心数小时
(Ikner et. Al., 2012)。超高速离心机很贵，通常一次只能处理很小体积的液体，少于50ml。因此，同样地不现实。除非你的水样含有大量病毒（如下水道污水），可是这由不了你。

提取环境水样中的病毒需要的是一个完全不同的技术。不用看病毒的大小或丰度，只要病毒能带电。大多数病毒在大于等于中性pH值时会带负电荷。让带负电荷的病毒通过带正电的吸附介质，病毒就能被捕获(Wommack et. al., 2009)。首先，用0.2μm滤膜把水中的细菌和其它大个头细胞过滤掉。然后让水样通过一个带电基质，通常使用微孔滤膜，筒式过滤器或玻璃纤维过滤器。当有病毒通过带正电的物质时，他们就会被静电捕获，粘附在基质上。

市面上常见的商业化带正电荷滤膜有Virozorb的1MDS和NanoCeram的Virus Sampler cartridges (Luisa A. Ikner et. Al. Appl. Environ. Microbiol. 2012)。这种带电基质一次最多能过滤多达20L水。你可以用高浓度盐把病毒从基质中洗脱下来。此时，病毒溶液被浓缩到很小的体积，方便用离心等方法进一步缩小到数百微升。100μl左右的体积可直接用DNA或RNA试剂盒进行提取了。

虽然病毒并不是水样中最主要的生物类型，但往往是最主要的致病因素（Suttle;2007）。怪不得很多客户都伸手要它们那微小的遗传物质。如果你有任何关于样品病毒提取的问题，无论是血液、香蕉，请尽管联系我们。

参考文献：

Wommack KE, Williamson KE, Helton RR, Bench SR, Winget DM; Methods Mol Biol. 2009;501:3-14. Methods for the isolation of viruses from environmental samples.

Luisa A. Ikner, Charles P. Gerba and Kelly R. Bright; FOOD AND ENVIRONMENTAL VIROLOGY; Volume 4, Number 2 (2012), 41-67, DOI: 10.1007/s12560-012-9080-2; REVIEW PAPER: Concentration and Recovery of Viruses from Water: A Comprehensive Review.

Luisa A. Ikner, Marcela Soto-Beltran and Kelly R. Bright; Appl. Environ. Microbiol. 2011, 77(10):3500. DOI: 10.1128/AEM.02705-10. New Method Using a Positively Charged Microporous Filter and Ultrafiltration for Concentration of Viruses from Tap Water.

Curtis A. Suttle; Nature Reviews Microbiology 5, 801–812 (1 October 2007); Marine viruses | major players in the global ecosystem.