土壤DNA提取试剂盒 中文说明书

UltraClean® DNA Isolation kit

土壤DNA提取试剂盒

 

简介

MO BIO的UltraClean® Soil DNA Isolation Kit已经成为了众多土壤微生物研究者的首选。可从土壤中国年提取高质量PCR级基因组DNA。

 

珠磨研磨

UltraClean® DNA Isolation Kit 不需要使用高速度强力珠磨研磨设备。若目的微生物需要比涡旋仪还要强力的均质器才能提取得到，此试剂盒也可以用在PowerLyzer™ 珠磨研磨机上。MO BIO现在专门提供了PowerLyzer™ PowerSoil® DNA Isolation Kit（货号：12855-50），一款使用了适合强力珠磨研磨的研磨珠套管的土壤DNA提取试剂盒。

 

相关产品	货号	数量
UltraClean® Mega Soil DNA Isolation Kit	12900-10	10 Preps
UltraClean®-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit	12896-4 12896-12	4×96 Preps 12×96 Preps
UltraClean® PCR Clean-Up Kit	12500-50 12500-100 12500-250	50 Preps 110 Preps 250 Preps
Vortex Adapter, holds 24 (1.5-2.0 ml) tubes	13000-V1-24	1 unit
Ceramic Bead Tubes, 1.4 mm Glass Bead Tubes, 0.5 mm Glass Bead Tubes, 0.1mm	13113-50 13116-50 13118-50	50 tubes 50 tubes 50 tubes
PowerVac™ Manifold	11991	1 manifold
PowerVac™ Mini System	11992	1 unit + 20 adapters
PowerVac™ Mini Spin Filter Adapters	11992-10 11992-20	10 adapters 20 adapters

 

设备要求：

微型离心机（10000g）

移液器（50μl~500μl）

Vortex-Genie®2 涡旋仪（MO BIO货号#13111-V-220）

涡旋仪适配器（MO BIO货号#13000-V1或13000-V1-24）

试剂盒组分

	货号：12800-50	货号：12800-100
组分	量	量
Bead Solution Tubes (contain 550  l solution)	50	100
Solution S1	3.3ml	6.6ml
Solution IRS	11ml	22ml
Solution S2	14ml	27.5ml
Solution S3	72ml	143ml
Solution S4	16.5ml	30ml
Solution S5	3ml	6ml
Spin Filters units in 2 ml tubes	50	100
2 ml Collection Tubes	15	300

△实验前请先逐一检查试剂!

 

保存

组分室温（15-30℃）保存。

 

操作步骤：

1、  加0.25~1g土壤样品到一个2ml bead solution tubes中。（要一次提取更大量土样，可选择UltraClean Mega Soil kit。关于加样量，可参考下文疑难点。）

这一步发生了什么：土样或粪便样品加入到Bead Tube 中。这是裂解细胞的首要步骤。Bead Solution是一个缓冲液，可分散开土样，并初步溶解腐植酸。

2、  轻轻涡旋混匀

这一步发生了什么：混匀样品与Bead Solution。

3、  检查S1。若出现沉淀，60℃水浴至全溶解。

这一步发生了什么：S1溶液含有SDS，温度过低时会产生沉淀。60℃孵育可重溶SDS，并可趁热使用】

4、  加入60μl S1，上下颠倒数次混匀

这一步发生了什么：S1容易含有SDS，作为去垢剂可破坏细胞膜结构。

5、  加入200μl IRS 溶液。（仅当最终DNA需要跑PCR是才需要添加，否则省略）

这一步发生了什么：IRT是专门设计用于去除腐植酸和其它PCR抑制因子的专利溶液。若最终DNA是用于PCR扩增，此步不能省略。腐植酸呈棕色。富含有机质的土壤通常含有大量腐植酸。

6、  把bead solution tubes安放到涡旋仪适配器中（货号13000-V1或13000-V1-24），或使用胶带固定在涡旋仪橡胶平板上。最大转速(3200rpm，若涡旋仪达不到此速度，可适当延长5~10min)涡旋振荡10min。（若使用24头涡旋仪一次处理多于12个样品，请把涡旋时间延长5-10min。）

这一步发生了什么：把Tube管牢靠地固定在涡旋仪上，对样品之间的一致性和DNA得率至关重要。只有胶带固定，容易在振荡过程中松开，影响研磨效果。我们已经设计出了专门用在涡旋仪上的适配器，可以紧紧卡住Tube管。

这步主要是引入机械作用力。在机械和化学试剂共同作用下裂解细胞。研磨珠不规则锋利外形与微生物细胞相互碰撞，破开细胞。

7、  室温10000g离心30s

这一步发生了什么：沉淀物含有细胞碎片、土壤、研磨珠以及腐植酸等。DNA在上清液中。

8、  转移上清到一个2ml 干净收集管中（视不同土壤类型，一般0.2g土样可获得400~450μl上清液，并可能混入少量土壤）

【注意：以加入0.25g土样计算，大约可获得400-450μl上清液，上清液中可能仍然带有部分土质。上清量因土壤类型不同可能有差异。

9、  加入250μl S2溶液，涡旋混合5s。4℃孵育5min。

这一步发生了什么：S2含有蛋白沉淀溶液。蛋白杂质会影响DNA纯度，并抑制下游DNA实验。

10     室温10000g离心1min

11     避开沉淀小球，转移450μl上清到一个干净的2ml收集管中

这一步发生了什么：沉淀物含有细胞碎片、土壤、研磨珠以及腐植酸等。为了更高的DNA得率和纯度，尽量避免吸到沉淀物

12     使用前摇匀S3溶液，加入900μl S3溶液到上清中，涡旋5s混匀

【注意：此时溶液可能很满，小心拿放。S3溶液为DNA绑定盐溶液。在高盐环境下，DNA会吸附绑定在硅胶薄膜上。】

13     加载700μl上清到一个Spin Filter中，10000g离心1min

14     弃去滤液，继续加载剩下的上清，10000g离心1min。注意，每个样品一共需要加载两次。

【注意：每次提取大概一共需要加载三次。DNA选择性地地府在硅胶薄膜上。其它成分则通过薄膜。】

15     加入300μl S4溶液，10000g离心30s

这一步发生了什么：S4是以酒精为主的洗液，可清除可能残留在薄膜上的高盐、腐植酸等其它杂质。注意：腐植酸较高的情况下你可以重复冲洗一遍。试剂盒配备的S4溶液有10%冗余。你还可以单独订购S4（货号：12800-100-4）。

16     弃去滤液

这一步发生了什么：滤液中只含有酒精洗液等废液。

17     室温10000g再次离心1min

这一步发生了什么：此步用于去除残留的S4溶液（含酒精）（也可吹干）。酒精成分去除不干净会影响电泳凝胶加样等下游实验，必须完全去除干净。

18     小心把spin filter转移到一个干净的2ml收集管中，避免S4溶液污染

这一步发生了什么：注意不要沾到任何S4溶液。

19     加入50μl S5到白色滤膜中央，

这一步发生了什么：S5（无菌洗脱缓冲液）要加入到薄膜中间，并保证整个薄膜能充分润湿。

20     10000g离心30s

这一步发生了什么：DNA随着洗脱液一起离心下来。DNA只在高盐环境下才吸附在硅胶滤膜上。S5溶液是pH8.0 10mM Tris缓冲液，不含盐。

21     弃去spin filter。此时收集管中的DNA可直接用于下游实验

    建议DNA冷冻保存（-20℃~-80℃）。S5溶液不含EDTA。

 

若使用PowerVac™ Manifold抽吸代替离心

每个样品使用一个Spin Filter离心管。保持Spin Filter安放在2ml Collection Tube中知道需要真空抽吸滤过。记号笔标记标注好Collection Tube顶部及Spin Filter。若Spin Filter在过滤过程中堵塞，仍可以改为常规离心继续继续提取DNA。

此操作说明书第四步需要外自备100%乙醇。

1、每一个样品需要安装一个铝质PowerVac™ Mini Spin Filter Adapter（MO BIO货号：11992-10或11992-20）到manifold的鲁尔接口上。轻轻用力安紧Spin Filter。关闭manifold其它所有不用的接口。

【注意：铝质PowerVac™ Mini Spin Filter Adapters可重复使用。】

2、加载650μl样品裂解物（接上文步骤12）到Spin Filter。

3、打开真空泵，打开使用的端口的阀门。打开阀门是扶稳Spin Filter，保持直立。等待裂解物全部通过滤膜，再加650μl裂解物。继续抽吸滤过。关闭阀门。

【注意：可关闭已抽滤的端口，以提高其它端口压力，加快抽滤速度。】

4、加入800μl 100%乙醇到Spin Filter。扶稳Spin Filter，打开阀门抽滤。抽滤完成后关闭阀门。

5、每个Spin Filter加入300μl S4溶液。打开阀门抽滤。当所有S4滤完后，继续抽滤1 min，抽干滤膜。关闭所有端口。

6、关闭真空泵。打开一个未使用的端口释放manifold的压力。若20个端口都在使用，断开真空泵连接。进入下一步操作前确保真空压力已释放。必须先关闭真空泵，防止滤液倒流。

7、拿下Spin Filter，放回到原来标记的相应2ml Collection Tube中。13000g离心1 min以充分干燥滤膜。

8、把Spin Filter转移到一个新的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中，加入50μl S5到白色滤膜中心。可选：可适用无菌DNA-Free Water洗脱DNA（货号：17000-10）。

9、室温10000g离心30s。

10、弃去Spin Filter。此时滤液中的DNA可直接用于下游实验，无需进一步处理。

 

获得最大得率可选操作：

接步骤10

11、避开沉淀小球，转移所有上清到一个干净的收集管中

12、S3溶液使用前先摇匀。加入1.3ml S3溶液到上清中，涡旋5s混匀。（溶液太满容易溢出，轻拿放）

接步骤13

 

疑点难点

加样量：

根据土壤类型，常规加样0.25-1g。吸水较多的如陶土，加样0.25g。水分较多的样品，见"湿土"部分。

部分土壤类型建议加样量：

土样类型	加样量（g）
底泥 Sediments	0.25
粘土 Clay	0.10
陶土 Potting Soil	0.10
园土 Garden Soil	0.250
砂土 Sandy Soil	0.250

 

湿土：

若土样水分含量很高，可把bead Tube内容物转移出去，土样加入到tube管，10000g离心30s。移液器尽量去除多余水分。Bead tube内容物移回来，接着步骤2继续。

 

可选裂解方法：

加入S1溶液后，涡旋3~4s混匀。加入IRS溶液，涡旋3~4s混匀，70℃孵育5min。再涡3~4s，70℃孵育5min。此可选步骤能增加DNA得率，但同时会降低DNA完整性。

最终DNA呈棕色

说明土壤中腐植酸含量很高。可重复15~18步S4溶液的冲洗过程。若最终DNA仍然颜色较深，尝试三倍稀释最终DNA，加入两倍体积的S3溶液，重新过柱、冲洗、洗脱。

 

若细胞难裂解

若细胞难于裂解，可先行70℃水浴10min，然后加入S1溶液。接着步骤5继续。

点击下载PDF版