提取粪便样品微生物DNA

我们常会收到刚开始入手粪便微生物组学研究者关于微生物提取的推荐处理程序、预期得率，以及合适的储存方法、运输条件等问题。

所以，为了帮助你们更好地规划实验，我们努力从粪便DNA提取和微生物组学分析专家那里收集相关技巧，让你可快速开展自己的微生物组学实验。

为了收集这方面的最有利信息，我们采访了主持Human Microbiome Project（HMP）样品收集和DNA提取流程开发的贝勒医学院分子病毒学和微生物学副教授Joseph Petrosino；微生物DNA提取试剂盒领先者MOBIO研发部主管Suzanne Kennedy；TGA Sciences研发助理研究员Kate Patterson。

以下五点来源于他们实验室的经验将有助于你项目的顺利开展。

1、采样

对于啮齿动物，最简单直接的办法是收集粪粒。动物关在笼子里，带上无菌手套捡拾笼舍底面的粪粒，放入到BD Falcon? 或Eppendorf Tube管这样的无菌装置中即可。

收集人的粪便样品或许有点脏。所以许多实验室提供一种桶状的装置，可放置在座厕下收集样品。也可以用报纸接着样品，以吸收更多水分。关键是要提供适当指导，避免样品受到厕纸或厕所壁的污染。指导也应该包括建议先排尿，避免尿液污染粪便样品。

若要收集肛周棉拭子，确认使用的是灭菌棉拭子，采样风干一个小时后放到带帽的无菌运输容器，避免微生物冷冻保存前降解。

2、样品运输与保存

样品收集后在DNA提取前可一直放在同一个容器里运输和保存。或者分装后放入到特殊灭菌收集容器中。

若样品是在家里自行收集的，应把样品容器放入到家庭冰箱中。快递到实验室时用冰袋保温。实验室中收集的样品可马上冷冻保存。HMP项目，要求样品在特定的收集容器中-80℃冷冻保存，24-48h内提取DNA。也有专家观察到冷冻保存长达一年的样品的微生物多样性与现场马上提取的区别不大。 做微生物多样性，我们的专家一致认为，用Qiagen的RNALater这类的保护液会影响下游DNA提取，请避免使用。有专家观察到使用RNALater的粪便样品容易分层，DNA回收率下降。(粪便样品运输包装.PDF)

重复样品分析可以减少处理过程、称重等环节带来的误差。但是在严格遵循最佳实验室规范、质量管理系统进行的微生物分析质量控制和质量保证程序下，无需重复样品。PhloChip分析也内建了质量控制程序保证分析结果。

3、分开处理健康与患病个体粪便

按照BSL-2规定条件分别处理健康与患病个体，包括戴好面具、手套及穿着实验室工作服，避免潜在病原感染。

便秘个体粪便在后续DNA提取中需要适当延长珠磨研磨时间，稀粪需要离心去除多余液体。

4、DNA提取

现有很多种方案从粪便样品中提取微生物DNA，而我们所有的专家都推荐使用珠磨研磨法和MOBIO的PowerSoil® DNA Isolation Kit。非珠磨研磨法无法回收格兰性阳性菌DNA。使用MOBIO的PowerSoil® Isolation Kit，最终洗脱DNA浓缩了为微生物DNA，PCR敏感度更高。人或动物的真核细胞在加热和珠磨研磨的环境下比微生物细胞更快裂解，DNA释放游离在上清液中。游离的DNA在长时间的机械作用力下断成小片段，绑定吸附步骤被冲洗掉。微生物DNA保存大分子片段状态留在硅胶离心柱上。

我们的专家们观察到PowerSoil® Kit这类采用珠磨研磨技术的试剂盒提取0.1g粪便样品约可获得100μl 2-20ng/μl 的总基因组DNA。人粪便或者肠内容物建议加样0.1-0.25g。较为干燥的老鼠粪便，建议减少加样量到0.1g。推荐使用试剂盒自带的研磨珠，没必要另外购买玻璃或者二氧化硅研磨珠。

有专家观察到人粪便DNA中约有2%的人类DNA。相反，其它类型的样品如阴道棉拭子提取的DNA最多可含80%人类DNA。

5、去除PCR抑制因子

粪便与土样一样带有大量PCR抑制因子。抑制因子的种类因饮食结构而异。抑制因子会吸附到离心柱硅胶滤膜上，伴随DNA一并被洗脱下来。这类样品的总DNA常呈黄至棕色，分光光度法读数偏低。因此，我们推荐使用MOBIO含有抑制因子去除技术?（IRT）的PowerSoil® DNA Isolation Kit，在绑定样品到离心柱前，去除裂解物中腐植酸、多酚、多糖、亚铁血红素和染料等杂质，可获得高纯度的DNA，扩增后得到更准确的微生物群落结构信息。

6、最后

参考文献

1. Impact of DNA extraction method on bacterial community composition measured by denaturing gradient gelelectrophoresis. Julia R. deLipthay et al. (2004) Soil Biology and Biochemistry. 36;10:1607-1614.

2. Manual of Procedures for Human Microbiome Project. | 相关产品信息链接更新.PDF

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MO BIO 粪便核酸相关提取试剂盒：

PowerSoil® DNA Isolation Kit

PowerFecal® DNA Isolation Kit

PowerMicrobiome™ RNA Isolation Kit

PowerMag™ Microbiome RNA/DNA Isolation Kit (Optimized for epMotion®)

PowerViral™ Environmental RNA/DNA Isolation Kit

粪便相关技术文章：

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粪便样品的保存与运输

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赞助商

MO BIO已成为自然杂志合作伙伴，独家赞助人类微生物群板块 此次合作，将获得自然杂志免费对外开放四篇最新发布的关于人类微生物文章的访问权。

“MO BIO通过开发系列针对粪便和肠内容物等复杂样品的核酸提取试剂盒，致力推动人类微生物组学研究”，MO BIO董事长及首席执行官Mark Brolashi说：“我们很高兴能有机会把如此重要的人类微生物组学出版法给科学家们开放。”

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