开发一种多重实时荧光定量PCR检测法检测 原料中反刍动物DNA监测肝素钠粗品质量

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作者

Sharla M. Peters¹, Yolanda L. Jones¹, Frank Perrella², Tai Ha³, and Haile F. Yancy¹

 

¹U. S. Food and Drug Administration, Center for Veterinary Medicine, Office of Research, 8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708, USA. ²U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Compliance, Silver Spring, MD 20993, USA. ³Nebraska Department of Agriculture, 301 Centennial Mall South, Lincoln, Nebraska 68508, USA.

 

摘要

开发一种实时荧光定量PCR技术检测猪源肝素钠粗品中的反刍动物源污染。该检测法由一套针对反刍动物（牛、绵羊、山羊）和猪的冻干引物、探针及内参组成。该方法经过两处分析机构验证：第一个位于FDA，第二个位于某州独立实验室。肝素钠多重实时荧光定量PCR（hMRTA）检测方法性能通过了美国FDA兽药中心研发处制定的特异性、灵敏度和专一性严格验收标准。符合早前建立的饲料中反刍动物原料多重实时荧光定量PCR检测法的灵敏度和重复性要求。hMRTA法检测猪源肝素钠粗品， 98%达灵敏度，真阳性98%、假阴性2%。PCR检测法检测三个反刍动物物种，可作为判定猪属来源的初步筛选、复查确认工具。进一步保证肝素钠粗品质量，帮助识别控制肝素钠生产来源物种。对粗品肝素钠的来源控制将保障含肝素钠药物和耗材的安全性，保护公众健康。

 

介绍

肝素钠粗品质量监控的工业指南 （草案），旨在帮助药物活性成分、药品及医疗器械生产厂家更好地控制使用的肝素钠粗品的质量，防止OSCS或来自反刍动物的污染。要求使用者建立适当的测试方法或使用USP方法来鉴别和控制动物来源的肝素钠粗品质量。USP专论里已作出规定，肝素钠应明确标明动物种类及器官组织的来源。要求采购肝素钠粗品的药物和医疗器械厂家要对每批肝素钠粗品在生产或准备生产含肝素钠药物或医疗器械前要鉴别其物种来源。

以下测定方法使用了实时荧光定量PCR技术检测肝素钠粗品反刍动物污染。用猪源、牛源标准物评估可靠性。识别猪源肝素钠粗品中的反刍动物DNA。

操作指南提供了方法的具体细节，包括所需试剂、设备。

 

材料及方法

建议每批待测样品（提取、纯化去杂质和PCR）都设立阴性对照。并同时给每批BioGX Ruminant and Porcine Beads设置商业化基因组DNA（牛、猪、山羊、绵羊）阳性对照。

 

1、DNA提取

介绍:

从0.5ml干燥肝素钠粗品中提取DNA的方法描述如下：请在提取操作开始前通读整篇标准操作流程。本方法使用了Invitrogen (Carlsbad, CA)生产的ChargeSwitch® gDNA Rendered Meat Purification Kit。所有的试剂、枪头和离心管均为DNase free。 枪头需有气溶胶抗性（Aerosol resistant），减少从DNA提取到PCR扩增过程中样品之间的交叉污染。因处理的是粉状物质，建议步骤1、2带上口罩，并与DNA提取、纯化和PCR地点隔离。

注意：粗品肝素钠的PCR检测需在其它会影响DNA完整性的任何前处理（如化学氧化）前进行，以免影响PCR物种检测结果。

 

1.1. 所需材料：

试剂盒：

ChargeSwitch® gDNA Rendered Meat Purification Kit (Product #CS400-100)

PowerClean® DNA Clean-Up Kit (Product# 12877-50)

BioGX Ruminant and Porcine Beads (Product # 204-0002)

 

设备要求:

Micro centrifuge

Heat Block

Nuclease Free Water

Vortex

Invitrogen Magna Rack

2.0 mL Tubes

Smart-Cycler

Smart Cycler centrifuge

Smart Cycler cooling block

SmartCycler 25 µL reaction tubes

 

1.2. 操作步骤

a. 加入混匀的肝素钠样品到2ml离心管的0.5ml标记线。

     *关键步骤：每次只加一个样，前一个样品加样完成前不能打开下一个离心管。

b. 加入1ml ChargeSwitch Lysis Buffer到样品中。往离心管加入裂解缓冲液时，离心管稍微倾斜。

c. 每样加入100μl ChargeSwitch SDS。涡旋5s混匀。

d. 95℃孵育（水浴或加热箱）5min。

e. 每样加入400μl ChargeSwitch Precipitation Buffer（N5）。涡旋5s混匀。

f. 冰浴离心管5min沉淀蛋白。

g. 室温16100g离心5min。

h. 转移1200μl上清液到一个新的离心管中。

i. 涡旋装有ChargeSwitch Magnetic Beads的离心管，充分重悬浸泡在储存缓冲液中的磁珠。

j. 加入200μl ChargeSwitch Detergent到含上清液的离心管中。

k. 加入40μl充分重悬的ChargeSwitch Magnetic Beads。

l. 上下吹打5次混匀。

m. 室温孵育1min。

n. 把离心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约

1min）。

o. 离心管留在磁铁上，小心吸掉上清不搅浑沉淀。吸取上清时枪头不要对着沉淀物。

p. 从磁铁取下离心管。

q. 加入1ml ChargeSwitch Wash Buffer到离心管，上下吹打5次混匀。

r. 把离心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约

1min）。

s. 离心管留在磁铁上，小心吸掉上清不搅浑沉淀。吸取上清时枪头不要对着沉淀物。

t. 从磁铁取下离心管。

u. 加入750μl  ChargeSwitch Wash Buffer到离心管，上下吹打5次混匀。

v. 把离心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约

1min）。

w. 离心管留在磁铁上，小心吸掉上清不搅浑沉淀。吸取上清时枪头不要对着沉淀物。

x. 加入750μl  ChargeSwitch Wash Buffer到离心管，上下吹打5次混匀。

y. 把离心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约

1min）。

z. 离心管留在磁铁上，小心吸掉上清不搅浑沉淀。吸取上清时枪头不要对着沉淀物。最后一次

清洗，吸掉所有上清。

aa. 从磁铁取下离心管，此时管内不应有上清液。

bb. 加入75μl ChargeSwitch Elution Buffer（E5）到离心管。

cc. 轻轻上下吹打10次重悬ChargeSwitch Magnetic Beads。

dd. 室温孵育1min。

ee. 把离心管放到MagnaRack上直至ChargeSwitch Magnetic Beads形成紧密沉淀，上清变清澈（约

1min）。

ff. 离心管留在磁铁上，小心转移含有DNA的上清到一个新的灭菌了的2ml离心管中，勿搅动

沉淀。吸取上清时，枪头不要对着沉淀。

gg. 弃去用过了的ChargeSwitch Magnetic Beads。

*DNA -20℃冷冻保存或继续进行DNA纯化去杂质

 

2. DNA纯化去杂质 

介绍：

下文描述如何去除以上提取的肝素钠粗品DNA 中PCR抑制因子（如肝素）。在纯化去杂质开始前需通读整篇标准操作流程。本段使用MOBIO（Carlsbad, CA）的PowerClean® DNA Clean-Up Kit。试剂盒提供的所有试剂盒离心管均DNase free。

 

2.1. 操作步骤

a. 加入75μl nuclease free水到DNA样品中。

b. 加入750μl PowerClean DNA Solution 1到DNA中。上下颠倒3-5次混匀。

c. 加入20μl PowerClean DNA Solution 2，上下颠倒3-5次混匀。 

注意：检查PowerClean DNA Solution 2，若有沉淀，60℃水浴并轻摇直至沉淀全部溶解。不要剧烈摇晃以免产生大量泡沫。可趁热使用。

d. 加入85μl PowerClean DNA Solution 3，上下颠倒3-5次混匀。4℃孵育5min。

e. 室温10000g离心1min。

f. 避开沉淀，转移所有上清到一个干净的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。

g. 加入70μl PowerClean DNA Solution 4，上下颠倒3-5次混匀。4℃孵育5min。

h. 室温10000g离心1min。

i. 避开沉淀，把上清转移到一个干净的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。

j. 摇匀PowerClean DNA Solution 5。加入800μl PowerClean DNA Isolation 5到上清中，涡旋5s

混匀。

k. 加载600μl上清液到Spin Filter中，室温10000g离心1min。

l. 弃去滤液，把剩余的600μl上清都加到Spin Filter上，室温10000g离心1min。

m. 弃去滤液。加入500μl PowerClean DNA Solution 6到Spin Filer，室温10000g离心30s。

n. 弃去滤膜。

o. 室温13000g离心2min。

p. 小心把Spin Filter转移到一个新的2ml Collection tube（试剂盒提供）中。避免沾到任何PowerClean DNA Isolation 6。

q. 加入75μl PowerClean DNA Solution 7到白色滤膜中心。

r. 室温10000g离心30s。

s. 弃去Spin Filter。-20℃冷冻保存直至PCR扩增。

 

 3. 实时荧光定量PCR扩增

设计该操作流程/步骤是为使用Cepheid的SmartCycler分析猪源肝素样品中反刍动物DNA的存在。在其他操作平台上使用该步骤需要适当的加以调整以验证这部分是否符合（相对应平台的）标准程序。

 

3.1. 准备实时检测

a. 从冰箱中取出装有样品制备珠管的可重复用密封袋。从密封区域顶部的缺口
撕开袋子。

b. 从袋中取出所需数量的管子，并轻轻打开每一根管子。

c. 向每管中加入25 µL无核酸水（无核酸污染的水），用枪头混合后盖上管盖。

d. 使用微量离心机将所有管子快速离心5s。

e. 珠子空白对照（珠子+无DNA的水）必须与每一批待测样品同时检测。

 

3.2. 步骤

a. 分装25 µL先前准备好的预混液（珠子和水）至SmartCycler PCR反应管。

b. 向每一根对应的PCR反应管中加入1 µL样品。

c. 盖上管盖，在SmartCycler离心机中离心5s。

d. 将PCR反应管放入SmartCycler区块的每一孔中并盖上各个盖子。

e. 准备运行程序：

f. 点击"Create Run"图标。染料设置选择FCTC。

g. 选择操作规程（见3.3部分）。

h. 选择适当数量的位点（即在运行的PCR管的数量）

i. 给每一个位点标注一个与每管组分相对应的样品ID。

j. 点击"Start Run"。

注：阳性结果需要有一个循环阈值（Ct值）。

 

3.3 PCR反应条件

这一操作规程必须在PCR运行开始前加以设定。使用唯一的名称保存参数。

 

PCR程序：

第一阶段：95.0°C 120s（光学元件关闭）

第二阶段：45个循环

95.0°C 10s（光学元件关闭）

56.0°C 60s（光学元件开启）

注：分析时，Ct值应设定成缺省值30

 

4. 结果分析

染料设定为FCTC，用于荧光检测。反刍动物DNA的阳性结果的判定是一个样品在FAM通道45个反应循环之前出现Ct值。猪的材料的阳性结果是在TxR通道出现阳性的Ct值。内部扩增控制（IAC）在Cy5通道中报告，有助于降低假阴性报告。许多不同类型肝素样品含有抑制剂。本试验包括一个IAC，以确保PCR的条件是合适的，这样，最大限度地减少由热启动酶的抑制造成的假阴性结果报告。具体地讲，IAC可以反映样品中存在PCR抑制因子时报道的阴性结果。引物与探针能结合反应混合物中合成的序列。

当样品中没有PCR抑制因子，而靶目标没有扩增时，IAC应当产生Ct值为32-37之间的信号。如果目标样品是高浓度，IAC可能会也可能不会报告由于竞争而出现的扩增。这是正常的。

如果IAC在Ct值37处仍未出现，或者在目的扩增中没有报告（其Ct值），样品可能含有阻止目的检测的PCR抑制剂。如果观察到这一结果，建议将分装的新的肝素粗品重提并额外纯化后使用。

对于反刍动物样品的阳性结果，应当用PCR对同一DNA样品额外检测两次，即全部三次检测结果均为阳性的，则确认该样品为阳性。

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