粪便样品的保存与运输

MOBIO最近新发布了产品，PowerMicrobiome RNA Kit 和PowerMag Microbiome RNA/DNA Isolation Kit，随之而来有非常多关于粪便DNA和RNA提取方面的咨询。其中最常问到的是，粪便样品在进一步处理前应如何储藏运输。

我询问了人类粪便/肠内容物方面的专家Dr. Rob Knight。Dr. Knight的实验室在American Gut Project中扮演了重要角色，它接收着来自美国各地寄来的粪便样品。

Rob谈及他在2010年发布的一篇文章，关于不同温度条件下储存的粪便样品微生物群落的结构和变化（1）。他的实验表明，在长达两周室温下保存的粪便样品中的微生物群落结构保持完好，只有极小的变化。因此，室温或使用普通冰袋运输粪便样品都是可以的。

从微生态学角度解释这个现象。不同个体的粪便是由占不同百分比的胆汁、胆红素、亚铁血红素和消化了的食物组成的复杂环境。保护微生物所处原生环境是维持微生物处于静止状态的最好方法。加入含高浓度盐的防腐剂在变性蛋白的同时也会杀死部分微生物（若你经常进食快餐和速冻披萨，那你的微生物可能比较适应防腐剂中添加的盐）。加入变性化学试剂极大改变所处微生态环境，防腐剂作用下仍能存活下来的微生物，在长时间的保存过程中也会不可避免地发生变化。为保护粪便样品DNA和RNA所采取的防护措施，必须以细胞不破裂，维持微生物多样性为前提。

反复冻融对微生物是有害的，解冻过程中冰晶体会促使细胞破裂。所以，避免样品反复冻融可减少不稳定菌种的损失。对于RNA提取，反复冻融的危害更不用说。

对于RNA

粪便RNA提取呢？需要用到一些特殊的技巧。 我们在实验室提取粪便RNA过程中发现了这样一些问题。第一，粪便中充满死细胞，宿主的和微生物的。大量降解的RNA在电泳或生物分析仪中对提取的RNA造成严重的背景干扰。若RNA离心柱绑定吸附过程中使用的乙醇由原来的100%换用70%，离心柱回收过程可以除去低分子量的RNA。当然，如果你对microRNAs也感兴趣，这个步骤还是可以继续使用100%酒精。

另一个重要因素是影响粪便容积和重量的粪便中未消化食物的数量和种类，直接减少实际进入处理的微生物细胞数量。我们有客户已经研发出了RNA提取前去除粪便样品中未消食物的方法，可大大提高回收的完整RNA得率。如果你感兴趣，请联系我们。

最后，提取过程中尽快加入稳定剂是获得高质量RNA的关键。有两种稳定剂你可加入到裂解缓冲液中。一是最常用的β巯基乙醇（BME）。β巯基乙醇是种强力还原剂，RNase有二硫键。还原剂破坏酶的空间结构致使灭活。BME可不可逆地破坏RNase，但其难闻的气味着实令人难受，不过至少可以拒推销人员于门外，免得他们打扰你的实验……

另一个选择是加入酚氯仿pH7-8（PCI）。只要加入100μl就可灭活核酸酶，起稳定作用。加样前先把稳定剂加入到裂解缓冲液中，样品可快速得到保护，避免进一步降解。尤其是刚从冰箱中取出的样品。若要给整块96孔板加粪便样品，处理时间至少一个小时，快速加入保护剂尤其重要。

对于已经加入RNALater作为保护剂的粪便样品，经过我们RNA和DNA提取的测试证明，它是有效的。但这类样品加样量要控制在100mg。RNALater中的盐与粪便成分相互作用形成沉淀。加入太多样品容易造成硅胶滤膜堵塞，大大影响回收率。

这是目前我们对粪便样品的了解，感谢与我们一起参与此计划的众多合作者。随着我们对这种独特而重要样品认知的增加，相信会有更多粪便研究技术会被开发出来。若你有任何建议或问题，请随时与我们联系！

• 1. Effect of storage conditions on the assessment of bacterial community structure in soil and human-associated samples. FEMS Microbiol Lett. 2010 June; 307(1): 80–86. Christian L. Lauber, Nicholas Zhou, Jeffrey I. Gordon, Rob Knight, Noah Fierer