强力水样DNA提取试剂盒中文说明书

PowerWater® DNA Isolation kit

强力水样DNA提取试剂盒

(提取已过滤水样的滤膜微生物基因组DNA)

 

 

简介

PowerWater® DNA Isolation Kit可提取各种过滤好的水样基因组DNA。利用我们的专利抑制因子去除技术®(IRT)，就算水样中含大量污染物，也能顺利地提取出高质量高得率的DNA。该试剂盒可兼容市面上所有类型的水样滤膜。与我们的UltraClean® Water DNA Isolation Kit不用在于：研磨珠套管改用了创新优化的研磨珠混合、修改的裂解缓冲液配方、IRT技术和减少样品体积使得可以在一个小型离心管中完成所有操作。最终DNA体积为100μl，可直接用于下游实验。

 

相关产品	货号	提取次数
Vortex Adapter for Vortex Genie® 2	13000-V1-15 13000-V1-5	Holds 4 (5 ml or 15 ml) Tubes Holds 6 (5 ml) Tubes
Water Filter Adapter	14800-10-WFA	1
Water Filter (0.45 µm)	14800-10-WF 14800-25-WF 14800-50-WF 14800-100-WF	10 units 25 units 50 units 100 units
Water Filter (0.22  µm)	14880-10-WF 14880-25-WF 14880-50-WF 14880-100-WF	10 units 25 units 50 units 100 units
Vortex Genie® 2 Vortex	13111-V-220 13111-V	1 unit (220V) 1 unit (120V)
PCR Water (Certified DNA-free)	17000-1 17000-5 17000-10 17000-11	1 ml 5 x 1 ml 10 x 1 ml 10 ml bottle
RapidWater™ DNA Isolation Kit	14810-50-NF       14810-100-NF	50 preps (No filters) 100 preps (No filters)
PowerVac™ Manifold	11991	1 manifold
PowerVac™ Mini System	11992	1 unit + 20 adapters
PowerVac™ Mini Spin Filter Adapters	11992-10 11992-20	10 adapters 20 adapters

 

设备要求

15ml离心机（≤4000g）

一次性/可重复使用滤过漏斗

滤膜（使用可重复使用滤过漏斗时）

微型离心机（13000g）

移液器

Vortex-Genie®2 涡旋仪（MO BIO货号#13111-V-220）

涡旋仪适配器（MO BIO货号#13000-V1-15或13000-V1-5）

真空抽滤系统

 

试剂盒组分

	货号：14900-50-NF	货号：14900-100-NF
组分	量	量
PowerWater® Bead Tubes	50	100
Solution PW1	55ml	110ml
Solution PW2	11ml	22ml
Solution PW3	2×18ml	3×24ml
Solution PW4	2×18ml	3×24ml
Solution PW5	2×18ml	3×24ml
Solution PW6	5.5ml	11ml
Spin Filters	50	100
2 ml Collection Tubes	250	500

△实验前请先逐一检查试剂!

 

保存

组分室温（15-30℃）保存。

 

操作步骤：

PW1溶液使用前55℃预热5-10min。趁热使用。使用前检查PW3，若有沉淀则55℃水浴5-10min，可趁热使用。

1、使用离心机和一次性或可重复利用漏斗过滤水样。含0.22μm或0.45μm滤膜的一次性滤过漏斗可从MO BIO单独订购。过滤水样的体积视水样微生物丰度和浑浊程度而定。（水样类型参照附文疑难点）。

这一步发生了什么：过滤水样，微生物截留到滤膜表面及滤孔中。

2、取下过滤装置漏斗部分。

3、使用两只灭菌镊子从边缘夹起滤膜，滤膜上面朝内卷成圆筒状。

【注意：不要卷太紧或折叠滤膜。"卷滤膜方法"可在以下网址观看展示视频。http://www.anbiosci.com/products/14900.htm】

4、把滤膜放入到5ml PowerWater® Bead Tube中。

这一步发生了什么：稍卷滤膜放入PowerWater® Bead Tube中装备珠磨研磨。

5、往PowerWater® Bead Tube加入1 ml PW1溶液。

【注意：PW1溶液使用前必须先预热溶解沉淀并趁热使用。若样品中含有难裂解微生物（真菌、海藻），可加入额外水浴步骤。详见附文疑难点。】

这一步发生了什么：PW1为含有去垢剂的强力裂解试剂，可破坏细胞壁，去除非DNA的有机、无机成分。同时也是IRT技术的组成之一。低温时会形成白色沉淀。55℃水浴不会影响其成分活性。需要趁热使用。】

6、把PowerWater® Bead Tube安装在MO BIO涡旋仪适配器，货号：13000-V1-15或13000-V1-5。

7、最大转速涡旋振荡5min。

这一步发生了什么：涡旋振荡的机械作用力在打碎滤膜释放出截留的细胞的同时辅助裂解细胞。使用涡旋仪适配器可提供相同的力矩和角度最大化研磨效果。避免使用胶带固定，以免震动过程中松脱影响研磨效果。

8、室温≤4000g离心1min。离心速度视乎离心机参数配置。（具备15ml离心条件可选步骤，不离心的情况会稍微减少获得上清的量）。

9、使用1ml枪头深入到研磨珠底部吸取上清，并转移到一个干净的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。

【注意：必须把枪头深入到研磨珠底部。多次吸取确保取出所有上清。上清中混入研磨珠不影响后续。根据使用滤膜的类型，约可获得600-650μl上清。】

这一步发生了什么：从滤膜和研磨珠中获得上清。

10、13000g离心1min。

这一步发生了什么：这一步去除混入的研磨珠、蛋白和细胞碎片。必须去除所有的非DNA有机、无机成分，否则将影响DNA纯度并抑制下游DNA实验。

11、避开沉淀，转移上清到一个干净的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。

12、加入200μl PW2，稍微涡旋混匀，4℃孵育5min。

这一步发生了什么：PW2溶液为IRT技术的又一个重要组成。第二次移除非腐植酸、细胞碎片、蛋白等非DNA的有机、无机成分。必须去除所有的非DNA有机、无机成分，否则将影响DNA纯度并抑制下游DNA实验。

13、13000g离心1min。

14、避开沉淀转移上清到一个干净的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。

这一步发生了什么：进一步去除非DNA有机和无机物。为了确保DNA得率和质量，避免吸入任何沉淀物。

15、加入650μl PW3，涡旋混匀。

【注意：PW3溶液若有沉淀，使用前先55℃水浴5-10min，可趁热使用。】

这一步发生了什么:PW3为高浓度盐溶液。DNA在高盐条件下将选择性地吸附到离心柱硅胶滤膜上。而滤膜上非DNA有机无机物仍然有可能少量残留。

16、加载650μl上清到一个Spin Filter中，13000g离心1min。弃去滤液重复上述步骤直到过滤完所有上清。

【注意：通常需要加样两次。】

这一步发生了什么：DNA选择性地吸附到离心柱硅胶滤膜上，滤液不含DNA成分。

17、把Spin Filter放到一个干净的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。

这一步发生了什么：PW3为高浓度盐溶液，Spin Filter转移到新的Tube管中，等待冲洗步骤，以提高DNA得率和纯度。

18、PW4使用前先摇匀。加入650μl PW4，13000g离心1min。

这一步发生了什么：PW4为含酒精冲洗液，用于冲洗离心柱滤膜上的DNA。去除残留的盐分等杂质。

19、弃去滤液，加入650μl PW5溶液，13000g离心1min。

这一步发生了什么：PW5能确保完全去除PW4成分，可提高DNA纯度和得率。

20、弃去滤液，13000g离心2min，充分甩干冲洗液。

这一步发生了什么：二次离心去除残留PW5溶液。PW5溶液含酒精，必须充分去除以免影响DNA后续实验。

21、把Spin Filter放到一个干净的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中。

22、加入100μl PW6到离心柱白色滤膜中心。

这一步发生了什么：PW6溶液（无菌洗脱液）加到滤膜中心湿润整个滤膜。DNA在高盐条件选择性吸附到硅胶滤膜上，PW6溶液（10mM Tris）无盐条件下选择性地洗脱下来。

可选：此步也可以用无菌的DNA-Free PCR Grade Water（货号：17000）洗脱硅胶滤膜上的DNA。PW6溶液不含EDTA。若为减少DNA降解，可用无菌TE溶液代替PW6洗脱DNA。

23、13000g离心1min。

24、弃去离心柱。此时DNA可直接用于下游实验，无需进一步处理。

建议DNA（-20℃-80℃）保存。PW6溶液不含EDTA。

 

若使用PowerVac™ Manifold抽吸代替离心

每个样品使用一个Spin Filter离心管。保持Spin Filter安放在2ml Collection Tube中知道需要真空抽吸滤过。记号笔标记标注好Collection Tube顶部及Spin Filter。若Spin Filter在过滤过程中堵塞，仍可以改为常规离心继续继续提取DNA。

此操作说明书第四步需要外自备100%乙醇。

1、每一个样品需要安装一个铝质PowerVac™ Mini Spin Filter Adapter（MO BIO货号：11992-10或11992-20）到manifold的鲁尔接口上。轻轻用力安紧Spin Filter。关闭manifold其它所有不用的接口。

【注意：铝质PowerVac™ Mini Spin Filter Adapters可重复使用。】

2、加载650μl样品裂解物（接上文步骤15）到Spin Filter。

3、打开真空泵，打开使用的端口的阀门。打开阀门是扶稳Spin Filter，保持直立。等待裂解物全部通过滤膜，再加650μl裂解物。继续抽吸滤过。关闭阀门。

【注意：可关闭已抽滤的端口，以提高其它端口压力，加快抽滤速度。】

4、加入800μl 100%乙醇到Spin Filter。扶稳Spin Filter，打开阀门抽滤。抽滤完成后关闭阀门。

5、PW4使用前先摇匀。每个Spin Filter加入650μl PW4，打开阀门抽滤。当所有PW4滤完后，继续抽滤1min，抽干滤膜。关闭所有端口。

6、每个Spin Filter加入650μl PW5溶液，打开鲁尔接口阀门，开启真空泵抽滤。当所有PW5滤完后，继续抽滤1min。关闭所有端口。

7、关闭真空泵。打开一个未使用的端口释放manifold的压力。若20个端口都在使用，断开真空泵连接。进入下一步操作前确保真空压力已释放。必须先关闭真空泵，防止滤液倒流。

8、拿下Spin Filter，放回到原来标记的相应2ml Collection Tube中。13000g离心2min以充分干燥滤膜。

9、把Spin Filter转移到一个新的2ml Collection Tube（试剂盒提供）中，加入100μl PW6到白色滤膜中心。可选：可适用无菌DNA-Free Water洗脱DNA（货号：17000-10）。

10、室温13000g离心1min。

11、弃去Spin Filter。此时滤液中的DNA可直接用于下游实验，无需进一步处理。

 

疑点难点

水样类型

A. 清亮水样：水样可清亮，也可非常浑浊。较干净的水可大量过滤不堵塞滤膜。可饮用水根据水的质量和颗粒数量也过滤100ml 到10L。也有报道过滤更大体积的。

B. 浑浊水样：浑浊水样有大量悬浮颗粒或者沉淀物，容易堵塞小孔径（0.22μm）滤膜。这类水样建议用0.45μm孔径滤膜。MO BIO单独有提供含0.22μm或0.45μm滤膜一次性漏斗（订货信息见第一页）。也可以把水样置于容器中澄清。若不具备澄清条件或不想对水样澄清，可适用孔径一大一小层叠过滤水样。下层放一小孔径滤膜，上层放一1μm孔径滤膜，大滤膜截留大块碎片，小滤膜截留微生物细胞。可用双蒸水或磷酸盐缓冲液冲洗上层大孔径滤膜，以增加下沉小孔径滤膜截留的微生物数量。虽然不能100%有效，但也可以增加微生物DNA的得率。

水样滤膜选择

MO BIO提供的含滤膜一次性漏斗可供大多数水样研究和检测使用。0.22μm孔径的滤膜含聚苯醚砜（Pall Supor®），而0.45μm孔径滤膜为醋酸纤维素制成。有些类型滤膜含有或容易吸附PCR抑制因子。为了减少此情况的发生，使用前先做评估。

忘记预热PW1

若忘记预热PW1，而其它操作都正常。你仍能获得DNA，不过得率可能比较低。

 

可选裂解方法

加热可辅助裂解某些类型生物体（真菌、藻类）以提高得率。步骤5后，对PowerWater® Bead Tube 65℃水浴10min，步骤6接着继续。

 

DNA期待得率

根据水样类型、采样地点，甚至季节，DNA得率都可能差异很大。下表给出了得率参考值。基于样品的多样性，下列数值只供参考。

 

A260/230数值偏低

A260/230读数只反映DNA纯度。低微生物丰度的样品，DNA得率（20ng/μl）也低，其比率可能低于1.5。该比率并不能反映DNA样品的可扩增性或DNA完整性。酒精浓缩法把DNA浓缩成更高浓度有助于提高A260/230比值。

 

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更多产品疑问，请参阅 http://www.anbiosci.com/pages/FAQ.htm "水样"部分。