粪便RNA提取试剂盒中文说明书

PowerMicrobiome™ RNA Isolation Kit

粪便RNA提取试剂盒

 

简介

PowerMicrobiome™ RNA Isolation Kit设计用于简便快速提取粪便、肠内容物、干粪、口腔棉拭子、分泌物等富含PCR抑制因子样本总RNA。专利IRT技术（Inhibitor Removal Technology®）能完全去除这些样本中含有的PCR抑制物，如未完全消化的植物成分、裂解红细胞的亚铁血红素等。试剂盒含DNase I及相应试剂，可去除可能污染的基因组DNA。最终RNA洗脱浓缩在RNade-Free Water中，可直接用于cDNA synthesis或RT-qPCR等下游实验。

 

操作预览

建议粪便或生物固体加样0.25g。粪便采样后尽快-80℃保存，以保护RNA完整性。

化学裂解缓冲液与0.1mm玻璃研磨珠，共同作用充分裂解微生物细胞。绑定液（PM3）把RNA吸附到离心柱滤膜上，DNase消化残余的基因组DNA后，冲洗并洗脱到RNase-free Water中，最终RNA可直接用于RT-qPCR等下游实验。

若实验要求RNA需要再一步DNase处理，建议使用DNase Max™ Kit（货号：15200-50），一种全新的室温稳定保存的DNase完全去除基因组DNA。只需20min即可消化掉30μg DNA，无需加热或EDTA干涉，采用特制的树脂能轻易去除DNase酶。使用DNase Max™ Kit处理完以后，RNA仍能保持原有的高质量。

 

 

相关产品	货号	数量
DNase Max™ Kit	15200-50	50次
Vortex Adapter, holds 24 (1.5-2.0 ml) tubes	13000-V1-24	1 unit

 

样本储存与保护

从粪便微生物中提取的RNA的得率和完整性很大程度上受个体消化系统功能、特定饮食菜单以及收集样本到-80℃保存耗时长短影响。粪便主要成分是水（65-85%）、未完全消化食物、胆汁、胆红素（由死亡红细胞衍生）和死亡细菌（可达50%）等。因为存在大量的死亡或濒死细菌及人体细胞，从粪便中提取的RNA用标准分析方法鉴定能看到一定成都的降解。QPCR检测从粪便或肠内容物提取的RNA应注意设计检测小片段RNA，以提高检测的灵敏度。

为了提供粪便RNA的质量，最好采集后尽快处理。可分装后-80℃冷冻，避免大块样本反复冻融。从冰箱中取出的样本，完全溶解前就可以加入含βME的PM2裂解缓冲液到Bead Tube中。马上加样开始研磨以促使保护液能充分浸泡到细胞RNA。新鲜采集未经冷冻的样品，也应该立即加入裂解缓冲液进行研磨，以获得最好质量的RNA。

 

设备要求：

微型离心机（13000g）

Vortex-Genie®2 涡旋仪（MO BIO货号#13111-V-220）

涡旋仪适配器（MO BIO货号#13000-V1-24）

自备试剂:

β巯基乙醇

 

选用试剂：

苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1） pH6.7-8.0（Amresco 货号：0883-100,0883-400）

 

试剂盒组分

	货号：26000-50
组分	量
Glass Bead Tubes, 0.1mm	50
Solution PM1	36 ml
Solution PM2	11 ml
Solution PM3	36 ml
Solution PM4	3×24 ml
Solution PM5	3×24 ml
Solution PM6	2.5 ml
Solution PM7	23 ml
Solution PM8	5.5ml
DNase I （RNase-Free）, 15000units	1  vial
Spin Filters	50
2 ml Collection Tubes	200

△实验前请先逐一检查试剂!

 

保存

DNase I 4℃保存，重悬分装后-20℃保存。其它组分室温（15-30℃）保存。

实验开始前注意事项

PM1使用前必须55-60℃水浴至完全没有沉淀，可趁热使用。PM5使用前摇匀。

 

β巯基乙醇加入到PM1，制备PM1/βME溶液

把β巯基乙醇（βME）加入到PM1溶液中，使最终浓度达到10μ/ml。PM1/μME溶液随着时间推移会失效，最好现配现用，保存时间不要超过一个月。每次提取需要650μl PM1/βME溶液。也可以直接把650μl PM1溶液和6.5μl βME加入到玻璃珠研磨管中。

    注意：处理βME时请在通风橱中进行。

 

制备DNase I

A. 把300μl RNase-FreeWater（PM8溶液）加入到DNase I（RNase-Free）冻干粉中，轻摇混匀。以50μl分装，-20℃保存。

        注意：DNase I不能反复冻融超过3遍。

B. 在实验前制备DNase I溶液，化冻足够量的DNase I，每次提取需要5μl一地步稀释保存的 DNase I和45μl的PM6。

如：

样品数量	稀释保存的DNase I	PM6溶液
1	5μl	45μl
2	10μl	90μl
10	50μl	450μl

 

操作步骤：

1. 加入0.25g粪便或生物固体（biosoild）到Glass Bead Tube，0.1mm中。

    注意：若希望用苯酚裂解法，加样后可加入500μl 苯酚/氯仿/异戊醇 pH6.5-8.0到Bead Tube中。

2. 加入650μl PM1/βME（见前文制备步骤）到Glass Bead Tube,0.1mm中。或直接加入650μl PM1和6.5μl到Glass Bead Tube中。

3. 把Glass Bead Tube,0.1mm固定在MOBIO 涡旋仪适配器上（货号13000-V1或13000-V1-24）。Tube管螺帽调整，朝适配器中心方向。

4. 最大转速连续涡旋振荡10min。

这一步发生了什么：化学裂解液和珠磨研磨同时裂解破碎细胞。裂解液还能保护释放到上清液中的RNA。

5. 室温13000g离心1min。把上清转移到一个干净的2ml收集管中（试剂盒提供）。约可获得500-600μl上清。若加入的是把苯酚/氯仿/异戊醇，把上分离层转移到一个干净的2ml收集管中。

这一步发生了什么：蛋白、细胞碎片与研磨珠一起沉淀下来，上清中含有人和细菌RNA及DNA。

6. 加入150μl PM2溶液，稍微涡旋混匀。4℃孵育5min。

这一步发生了什么：PM2溶液为抑制因子去除溶液，作为IRT技术一部分可完全去除样品很重含有的抑制下游PCR及其它应用的抑制因子。

7. 13000g离心1min。

8. 避开底部沉淀，转移不多于650μl上清到一个干净的2ml收集管中（试剂盒提供）。

9. 加入650μl PM3溶液和650μl PM4溶液，稍微涡旋混匀。

      注意：为了防止小片段RNA（5S，tRNA及降解的RNA）与正常的mRNA、rRNA共同洗脱下来，可用650μl 100%乙醇代替PM4溶液。

      若为了同时洗脱如mciroRNA和siRNA等小片段RNA，可把裂解物转移到一个可至少能容纳2.6ml的Tube中，加入650μl 100%乙醇。这部分100% 乙醇需要自备。

这一步发生了什么：PM3为绑定盐溶液，可辅助提取总核酸，PM4溶液为100%乙醇。这些溶液为把RNA、DNA绑定到Spin Filter上创造化学条件。

10. 加载650μl 上清到Spin Filter上，13000g离心1min，弃去滤液。重复步骤直至过滤完所有上清。

      注意：一般共需要加载三次上清。若为了提高microRNA和siRNA而额外添加了100%乙醇，可能共需要加载四次。

11. 使用前先摇匀PM5。加入650μl PM5溶液，13000g离心1min。

这一步发生了什么：PM5为含异丙醇的冲洗缓冲液，可去除滤膜上残留的盐溶液，为DNase处理创造条件。

12. 弃去滤液，13000g再离心1min，以进一步去除残留的洗液。

13. 把Spin Filter放到一个干净的2ml 收集管中（试剂盒提供）。

      注意：若你想同时提取RNA和DNA，请忽略步骤14-16。

14. 加入50μl DNase 溶液（每个提取需要混匀45μl PM6溶液和5μl DNase I稀释液，详见上文DNase溶液的制备）。

15. 室温孵育15min。

这一步发生了什么：PM6溶液为DNase消化缓冲液，DNase浸润整个滤膜，消化其中的基因组DNA。

16. 加入400μl PM7溶液，13000g离心1min。

这一步发生了什么：PM7溶液可灭活DNase，并把降解的DNA冲洗下来。

17. 弃去滤液，加入650μl PM5溶液，13000g离心1min。

18. 弃去滤液，加入650μl PM4溶液，13000g离心1min。

这一步发生了什么：PM5和PM4为含异戊醇和酒精的冲洗缓冲液，洗脱RNA前分别出去离心柱上残留的盐分。

19. 弃去滤液，13000g离心2min，进一步去除残留的冲洗液。

这一步发生了什么：再一次离心确保滤膜上残留的乙醇全部去除，确保洗脱顺利进行。

20. 把Spin Filter放到一个干净的2ml 收集管中（试剂盒提供）。

21. 把100μl PM8溶液（RNase-Free Water）加入到离心柱滤膜中间，常温放置至少1min。

      注意：使用100μl PM8可获得最大的RNA洗脱得率。为了获得更浓缩的RNA，PM8用量也不能少于50μl。PM8用量不能低于50μl！

22. 13000g离心1min。

这一步发生了什么：RNA从滤膜上洗脱下来，进入到PM8（RNase-Free Water）中。此时RNA可直接用于下游酶实验。

23. 弃去Spin Filter。

    此时RNA可直接用于下游实验。装有RNA的Tube管可-80℃保存。

 

疑点难点

RNA降解

粪便样本最好的保存办法是-80℃冷冻保存，避免反复冻融。粪便固形物成分主要是含大量降解RNA的死亡的细菌，提取到完整RNA的同时抽提出大量小片段RNA是正常的。

为了减少小片段降解RNA，可步骤9中降低乙醇的浓度。用650μl 70%乙醇代替PM4.

若用RNALater保存粪便样本，请把加样量减少到0.1g以免堵塞离心柱。RNALater的使用要求对最终提取得到的RNA做进一步基因组DNA消化处理（推荐使用货号15200-50）。

裂解步骤中使用苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）pH6.7-8.0可有助于保护RNA完整性。加样前加入500μl苯酚/氯仿/异戊醇到Glass Bead Tube,0.1mm 中。对于大多数固态样本，水相和有机相分离不明显，而含水量高的样品可能可以看到清洗的分成。总之，取上层溶液进入下一步处理。

 

纯度很低

RNA理想纯度260/280值应为1.8-2.1,260/230值大于1.5。若RNA纯度不够，有可能跟处理的样本类型有关。若260/230读数较低，可增加PM2的用量至200μl以去除更多抑制因子。如果增加PM2用量后，RNA纯度仍不能让人满意，请减少加样量。

 

基因组DNA污染

根据样本中细菌数量情况，经过离心柱DNase消化后仍有可能残留少量基因组DNA。为了完全去除基因组DNA，可使用无需加热或EDTA干预RTS DNase™ Kit（货号：15200-50），以确保完全去除DNA。

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