土壤DNA提取Part II: 化学篇

作者：Suzanne kennedy 来源：美国MoBio实验室【字号：大 中 小】

接着前一篇文章关于如何提高土壤DNA提取得率的话题。我们已经十分彻底的谈了样品研磨裂解、选择研磨珠类型的重要性、研磨设备以及裂解缓冲液。从中你也可以发现，裂解步骤是提高得率的最值得钻研的地方。

研磨裂解后最终DNA抽提前，需要清洗去杂。这一步主要由抑制因子去除技术（IRT）完成。跟着操作说明书流程走，抑制因子去除完成后，文章的再下一段就是使用化学溶液配合硅胶离心柱抽提DNA了。

去除抑制因子：

把土壤样品研磨破碎后就可以进行PCR抑制因子去除工作。所谓的腐植酸其实就是使得样品呈现棕色的物质。如果样品中有植物残骸甚至生物薄膜（Biofilm），杂质中还会含多糖类物质。MO BIO以及Powersoil kits之所以在同行、同类试剂盒中出类拔萃就是因为其抑制因子去除。MO BIO实验室开发出了一个专利技术，叫抑制因子去除技术（IRT）。它能从细胞裂解物中沉淀去除腐植酸、多糖、多酚等。IRT技术分两步，先去除蛋白质和其它残骸，然后去除不溶性大分子絮状沉淀物。IRT处理后，样品看起来就清亮很多了。PowerSoil 和 PowerWater 经过实验计算使用了充足的IRS量来对付最最难搞的问题土壤。若最终依然存在有抑制因子（PCR扩增检测），重复一次IRS步骤。

IRT的第一步需要低温来加强絮状物形成。而第二步，我们建议不要延长孵育时间超过5min。试验证明过长孵育时间会降低DNA得率。

中点？

如果要临时中止实验，时间点最好是在IRS结束后，加入绑定液之前。把溶解产物存放在-20℃留到第二天再做硅胶离心柱绑定。

绑定到硅胶薄膜上：

此时，DNA已经可以过硅胶薄膜用于抽提了。一般上一步得到的细胞裂解产物应该是清亮的（如果土壤有机物含量很多，有可能微微发黄）。为了把DNA吸附到硅胶薄膜上，需要离液盐的帮助。绑定液（C4溶液）与溶解产物的比例是得率的又一关键点。绑定液用太多，会导致降解RNA过多回收；要是太少，大分子量的基因组DNA回收率就不高。所以，我们建议一个2ml Tube管，放750μl溶解产物，1.2ml绑定液。

如果实验过程中发现溶解产物不止750μl，那么你就需要相应地提高绑定液的量。或者说绑定液（C4溶液）2倍体积于溶解产物，这个比例最合适。这样的话，就需要把溶解产物分开到两个2ml Tube收集管，或者用大号Tube（5mL或15mL），并保证溶液充分混匀。

真空泵适配器(Vacuum Manifold )，可选：

通常情况下，吸附绑定到离心柱步骤需要加样3次。一个提高工作效率的办法就是试用PowerVac Manifold System.。如果你的实验室里头已经有了vacuum manifold ，那就只需要一套PowerVac Mini Spin Filter适配器。我们在实验室里就是通过这个方法提高工作速度。如果你需要处理超过建议量750μl的溶解产物和相应增加的绑定液，那么采用vacuum manifold就可以在加样4-5次的同时节约大量时间。

清洗:

因为IRT的缘故，土壤中的所有污染物都已经被去除干净，而无需像其它品牌试剂盒那样使用额外的高盐。此步骤的主要目的是去除残留在柱子上的离液盐。若不去除这些离液盐，DNA就很不容易洗脱下来，就算洗脱下来了也会被胍污染。清洗缓冲液中含有酒精成分可以溶解并洗掉残留的盐。通常清洗一次就可以了。要是发现260/230读数偏低（Nanodrop读数中230吸光率偏高），请再清洗一遍。如果发现清洗缓冲液用完了，100%无水乙醇同样可以作为替代来冲洗滤膜。vacuum manifold 操作说明中就有用到100%无水乙醇。

冲洗完了以后，记得甩干离心柱上的酒精。因为残留的酒精会影响DNA的抽提效率。

抽提:

最后一步是把DNA释放到10 mM Tris pH 8.0缓冲液中。DNA在中性或偏弱碱性的环境下容易降解。你可能会考虑使用水来稀释一下，但通常水pH值偏低（约4-5），效果可能不太理想。抽提过程中一个增加得率的小提示就是，在加入缓冲液后，离心前，室温孵育离心柱滤膜。1-5min的孵育可以帮助重悬浓缩DNA到一个更小的体积。但还是建议DNA抽提最终体积不要小于50μl，否则会残留大量DNA。

现在，你的DNA已经可以马上已经PCR扩增或者跑胶了。

常见问题：

通常土壤中有多少DNA？

讨论了那么多，你也许最想问的是，到底土壤一般含有多少DNA？答案是不定。土壤的含水量、有机物含量以及采集地点都会有影响。

在我们的实验室里头，"一般土壤"如园土，DNA得率可以达到2-5μg/0.25g（每个样）。我们也计算过大田土壤如草莓园，得率就很低，知道0.25μg/0.25g（每个样）。对于砂土、粘土等有机物含量较低的土壤类型，得率可能会更低。

我怎么做才能提高粘土和砂土的得率？

关于粘土和砂土的一个理论认为，释放出来的部分核酸被牢牢地绑定到了土壤本身里头去。文章结尾列举了几个文献关于防止微生物DNA损失的前处理方法。其中包括使用脱脂奶（1）。有证据表明二价阳离子在DNA吸附到土壤表面起了关键作用（2）。因此，有些客户在裂解步骤往研磨管中加入了EDTA并成功地最终获得50mM浓度的DNA。

总结：

文章中已经包含了我们所知道所有提取土壤DNA的技术提示和技巧。总的来说，不同土壤类型有其特点和微生物含量，以此预估DNA得率。而获得高得率和完整DNA关键步骤就是研磨和吸附绑定阶段。如果你的最终得率没有达到预期，解决思路就围绕着两点吧。请切忌，盲目提高土壤样品起始量并不能得到更多DNA。

我们一直非常乐意倾听您使用MO BIO试剂盒获得更好结果的意见和意见。请给我们写信，告诉我们你提取土壤样品DNA的独特技巧。

感谢你的耐心阅读！

参考文献：

• Microbes and EnvironmentsVol. 19 (2004) , No. 1 pp.13-19An Improved DNA Extraction Method Using Skim Milk from Soils That Strongly Adsorb DNAYuko Takada-Hoshino and Naoyuki Matsumoto
• FEMS Microbiology LettersVolume 97 Issue 1-2, Pages 31 - 39Adsorption of DNA on clay minerals: protection against DNaseI and influence on gene transferEric Paget, Lucile Jocteur Monrozier, and Pascal Simonet